把Cas9 protein 和 sgRNAs 加入到稀釋液中(0.25 mM EDTA/10 mM TrisHCl, pH7.4)，注射前，在37℃中放置10min。濃度是：Cas9，50ng/µl；sgRNA 是 30ng/µl.

把準(zhǔn)備好的Cas9 protein 和sgRNAs 混合液通過顯微注射，注射到受精后16-18h的胚胎細(xì)胞質(zhì)中。我們發(fā)現(xiàn)50ng/μl Cas9 和 30 ng/μl sgRNA 混合液非常有效，且不干擾胚胎細(xì)胞正常的分裂增殖。21個(gè)細(xì)胞中有12個(gè)細(xì)胞的基因被切割了。

注射了的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)48個(gè)小時(shí)后，再提取細(xì)胞的基因組，通過PCR擴(kuò)增剪切位點(diǎn)的DNA序列，分析編輯的效果。

   測(cè)序后，基因編輯結(jié)果：第一個(gè)是原始序列，后面的是編輯后的序列。-19代表刪除了19個(gè)堿基，+3代 表插入了3個(gè)堿基。紅色代表sgRNA，綠色代表PAM motif 。

                                 注射后對(duì)胚胎細(xì)胞的發(fā)育沒有影響

CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human zygotes using Cas9 protein